Nanotoksykologia
“Wpływ nanomateriałów na zdrowie człowieka: lekcje z modeli in vitro” to tytuł kończonego właśnie projektu finansowanego z Funduszu Norweskiego (Norwegian Financial Mechanism). Badano cytotoksyczność, genotoksyczność i stres oksydacyjny w komórkach ludzkich poddanych in vitrodziałaniu nanocząstek (NP). Są one zdefiniowane jako cząstki, których co najmniej jeden wymiar jest mniejszy niż 100 nm. W ostatniej dekadzie NP znalazły liczne zastosowania w przemyśle i medycynie. Ostatnio jednak pojawiły się zastrzeżenia, co do bezpieczeństwa tych zastosowań, obecności NP w produktach codziennego użytku i w środowisku. Nanocząstki srebra (Ag NP) wywołują w komórkach ssaków stres oksydacyjny, powodowany generowaniem RPT (reaktywnych postaci tlenu), upodabniając się pod tym względem do promieniowania jonizującego o niskim LET (liniowym przekazaniu energii). Traktowanie Ag NP powoduje zmiany genotoksyczne i mutagenne, zaburza mitochondrialny łańcuch oddechowy, spowalnia namnażanie komórek i śmierć komórkową.
Zbadaliśmy skutki uszkodzeń DNA spowodowanych przez traktowanie nieopłaszczonymi Ag NP 20 nm lub cząstkami srebra 200 nm oraz nanocząstkami dwutlenku tytanu (TiO2 NP) komórek 3 linii nowotworów ludzkich: raka wątroby HepG2, gruczolakoraka jelita grubego HT29 oraz raka płuc A549. Obrazy tych nanocząstek w mikroskopie elektronowym skaningowym (SEM) lub transmisyjnym (TEM) są na rycinach 1-4. Badane kryteria odpowiedzi komórkowej to pęknięcia nici DNA oznaczane metodą kometową, oksydacyjne uszkodzenia zasad rozpoznawane przez glikozydazę formamido-pirymidynową (FPG) i oznaczane metodą kometową + FPG, częstości ognisk histonu γH2AX i mikrojąder, apoptoza i przeżywalność klonogenna. Przykład wyników oznaczeń uszkodzeń DNA metodą kometową przedstawiono na ryc. 5. Każda z badanych linii komórkowych miała inny wzór zależności pęknięć nici DNA i uszkodzeń zasad od stężenia NP. i czasu traktowania. Nie stwierdzono wzrostu częstości ognisk histonu γH2AX i mikrojąder w stosunku do ich poziomu w komórkach nie traktowanych NP.
Omówione doświadczenia nie wskazały bezpośredniego związku uszkodzeń DNA indukowanych przez Ag NP lub TiO2 NP z wczesną apoptozą lub spadkiem przeżywalności kloogennej. Nie oznacza to, że uszkodzenia DNA indukowane przez NP są nieszkodliwe, zwłaszcza na poziomie organizmu. W przypadku nieprawidłowej naprawy, mogą one prowadzić do mutacji, w rezultacie powodując różne szkodliwe dla ludzkiego zdrowia następstwa, w tym predyspozycje do choroby nowotworowej, neurodegeneracji, defektów układu odpornościowego.
Inna grupa doświadczeń dotyczyła wpływu traktowania NP na naprawę uszkodzeń DNA indukowanych przez promieniowanie X. Stosując metodę kometową, zbadaliśmy działanie łączne Ag NP 20 nm lub cząstek Ag 200 nm oraz promieniowania X (2 Gy) w komórkach HepG2. Dla porównania, podobne oznaczenie przeprowadzone zostało dla TiO2 NP 21 nm +2 Gy X. Żaden z 3 rodzajów cząstek nie zmieniał poziomu uszkodzeń początkowych DNA po napromienieniu. Natomiast cząstki srebra (zwłaszcza Ag NP 20 nm) powodowały znaczny spadek szybkości łączenia pęknięć nici DNA. Traktowanie TiO2 NP nie miało wpływu na naprawę DNA (Ryc. 6).
Omówione prace wskazują, że Ag NP nie są bynajmniej tak bezpieczne, jak to wynikało z wczesnych badań i ich stosowanie powinno być poddane starannej kontroli.
Ryc. 1. Obraz z transmisyjnego mikroskopu elektronowego nanocząstek TiO2
Ryc. 2. Endocytoza nanocząstek TiO2 w komórkach A549
Ryc. 3. Obraz SEM nanocząstek Ag
Ryc. 4. Dystrybucja nanocząstek Ag na terenie jądra oraz cytoplazmy komórek A549
Ryc. 5. Uszkodzenia DNA (pęknięcia jednoniciowe, SSB i uszkodzenia zasad rozpoznawanie przez glikozylazę formamido-pirymidynową, FPG) w komórkach raka wątroby HepG2 traktowanych Ag NP, Ag 200 nm i TiO2 NP przez 2 h we wskazanych stężeniach. Gwiazdki wskazują statystycznie znamienną różnicę w stosunku do kontroli (test Studenta). Oznaczenie metodą kometową (3 niezależne powtórzenia); pokazane odchylenie standardowe.
Ryc. 6. Wpływ wstępnego traktowania nanocząstkami na naprawę uszkodzeń DNA indukowanych przez promieniowanie X. Litera (a) oznacza znamienną statystycznie różnicę w stosunku do kontroli, litera (b) oznacza znamienną statystycznie różnicę w stosunku do komórek otrzymujących tylko dawkę 2 Gy promieniowania X.
